فلوریمتری
فلورسانس اسپکتروسکوپی (اسپکتروفلوریمتری یا فلوریمتری) نوعی اسپکتروسکوپی الکترومغناطیسی است که خاصیت فلورسانس را در نمونه های مورد مطالعه، بررسی مینماید. در این تکنیک از یک اشعه نورانی با شدت مشخص، برای تحریک الکترونها استفاده میشود. در نتیجه الکترونها به سطوح بالاتر انرژی منتقل میشوند. در بعضی از مولکولها، بازگشت الکترونها به سطح انرژی اولیه، همراه با تشعشع فلورسانس است. با اندازه گیری شدت نور فلورسانس میتوان غلظت، خواص یا بر هم کنش مولکولها را مورد مطالعه قرار داد. فلوریمتری کاربرد وسیعی در بیوشیمی و پزشکی دارد. این تکنیک برای اندازه گیری بیومولکولها و تومور مارکرها و همچنین درتشخیص انواع سرطانها و تومورهای خوش خیم نیز مورد استفاده قرار میگیرد.
اسپکتروفتومتری
در روشهاي اسپکتروفتومتری (طيف سنجي)، تاثیر محلولها بر امواج الكترومغناطيسي مورد مطالعه قرار میگیرد. محدوده طيف الكترومغناطيس میتواند از اشعه ماوراء بنفش تا امواج راديويي باشد.
مقدار نور جذب شده توسط محلول، تابع قوانين Beer وLambert است و از رابطه A=e lc محاسبه مي شود. طبق قانون بیر، هر گاه یک اشعه نور تک رنگ از درون محلولی با رنگ مکمل عبور کند، مقدار نور جذب شده توسط محلول، با غلظت آن نسبت مستقیم دارد. طبق قانون لامبرت، مقدار نور جذب شده توسط لایه های مختلف محلول همواره ثابت بوده و با شدت نور تابیده شده بستگی ندارد. بر اساس قوانین بیر و لامبرت رابطه بین غلظت محلول و نور جذب شده به صورت خطی است و معمولا در محدوده اي كه جذب با غلظت رابطه خطي دارد، تعيين غلظت مواد انجام مي شود.اگر غلظت نمونه و استاندارد به هم نزديك باشد و غلظتها هم در محدوده خطي باشند، مي توان با استفاده از تناسب محاسبات را انجام داد.
دستگاه اسپكتروفتومتر از دو بخش اسپكترومتر و فتومتر تشكيل شده است. اسپكترومتر بخشي است كه نور منوكروم را ايجاد كرده و داراي منبع نور، عدسي، شكافها، منوكروماتور (صافي یا منشور) مي باشد. بخش فتومتر داراي اسباب سنجش نور است.
فلیم فتومتری
فلیم به معنی شعله می باشد. اتمهای هر عنصر در اثر تحریک با انرژی حرارتی رنگ خاصي را در شعله ايجاد مي کنند. يعني طول موج خاصي ايجاد مي کنند که رنگ حاصل شده نيز ناشي از آن است. دستگاه فيلم فوتومتر نيز که يکي از ابزارهاي مهم آزمايشگاه هاي پزشکي است، بر همين اساس ايجاد شده است.
بخار حاوي نمک مورد نظر و همچنين اکسيژن، وارد شعله مي شود سپس نور حاصل توسط فيلتر رنگی و عدسي متمرکز شده و سپس توسط فوتو دتکتور، به ولتاژ تبديل مي شود، اين ولتاژ تقويت شده و به نمايش در مي آيد. طول موج هاي رنگي که معرف مواد مختلف است به صورت پيک هايي در نمودار حاصل، قابل بررسی و اندازه گیری است.
روش فلیم فتومتری معمولا برای اندازه گیری الکترولیتها و فلزاتی نظیر سدیم، پتاسیم ،لیتیم و کلسیم مورد استفاده قرار میگیرد
کروماتوگرافی
کروماتوگرافی (chromatoghraphy) ، در زبان یونانی متشکل از کلمات chroma یعنی رنگ و grophein یعنی نوشتن است. اولین روش کروماتوگرافی در سال 1903 بوسیله میخائیل سوئت ابداع و نامگذاری شد. او از این روش برای جداسازی مواد رنگی استفاده کرد.
مارتین و سینج در سال 1952 به پاس اکتشافاتشان در زمینه کروماتوگرافی جایزه نوبل دریافت کردند.
کروماتوگرافی روشی برای جداکردن اجزای یک مخلوط است. مخلوط مورد مطالعه که معمولا به صورت مایع یا گاز است از یک لوله یا شبکه گذرانده میشود. در کروماتوگرافی دو فاز وجود دارد: فاز ثابت وفاز متحرک. جداسازی مواد بر اساس اختلاف در قدرت حل شوندگی آنها در فاز ثابت و متحرک است. بنابر این سرعت حرکت اجزای تشکیل دهنده مخلوط متفاوت است و در نتبجه مخلوط به اجزای تشکیل دهنده تفکیک میشود. ، فاز ثابت در واقع اجزای درون لوله یا شبکه جداسازی را تشکیل می دهد و فاز متحرک شامل حلال و ماده مورد مطالعه است. فاز ثابت می تواند مایع یا جامد باشد. انواع مرسوم کروماتوگرافی عبارتند از:
1. کروماتوگرافي ستوني Column Chromatography
2. کروماتوگرافي کاغذي Paper Chromatography
3. کروماتوگرافي نازک لايه Thin Layer Chromatography
4. کروماتوگرافي تعويض يوني Ion-Exchange Chromatography
5. کروماتوگرافي گازی Gas Chromatography
الکتروفورز
به سبب اینکه بسیاری از ماکرومولکول های زیستی باردار هستند، میتوان با استفاده از یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. روش های الکتروفورز مختلفی، برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است. برخی از روشهای الکتروفورز رایج در آزمایشکاه ها بشرح زیر است:
الف) الکتروفورز روی کاغذ (PE) Paper Electrophoresis
ب) الکتروفورز در ژل آگارز (AGE) Agarose Gel Electrophoresis
ج) الکتروفورز روی استات سلولز (CAE) Cellulose Acetate Electrophoresis
د) الکتروفورز در ژل آکريل آميد (AGE) Acrylamid Gel Electrophoresis
ه) الکتروفورز در ژل نشاسته ) Starch Gel Electrophoresis (SGE
الکتروفورز در ژل کاربرد وسیعی دارد. در این روش از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده میشود. الکتروفورز در ژل پلیاکریل آمید ( PAGE) PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته میشود. به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود، به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه میشود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی میباشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل میشود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل میشود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین میشود. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده میشود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر وآسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر میگیرد.. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشتهای و قطعات DNA تک رشتهای از ژل پلی اکریل آمید استفاده میشود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه 100 جفت باز از آگاروز 3% و برای قطعات حدود 2000 جفت باز از آگارز 8/0 % استفاده میشود.
سانتریفیوژ
روش سانتریفیوژ بر اساس نيروي گريز از مركز است. هر گاه جسمي با سرعت معيني حول يك محور دوران كند نيروئي در جسم متحرك و در جهت مماس بر مسير دوران و به سمت خارج از مركز ايجاد مي گردد كه به نيروي فراگريز يا گريز از مركز موسوم است و مقدار آن از رابطه F=MRW2 بدست می آید. R شعاع دوران، M جرم جسم، V سرعت خطي و W سرعت زاويه اي است. عوامل موثر در جداسازی ذرات عبارتند از:
1. جرم حجمی ذرات 2. شکل ذرات و 3. چگالی محلول
در دستگاه سانتریفوژ برای جدا کردن ذرات، مخلوط را درون لولهای قرار میدهند. این لوله با چرخش دستگاه، به سمت خارج از مرکز متمایل میشود و یا به حالت افقی در میاید. در این حالت، نیروی گریز از مرکز میخواهد که مخلوط را برخلاف مرکز سانتریفوژ براند و از این نقطه دور کند و ذرات یا مایع سنگین تر بیش تر به سمت بیرون (یا ته مخلوط) رانده میشوند. وقتی سانتریفوژ از حرکت باز میایستد، مواد به همین حالت غیر مخلوط میمانند. خون و سایر نمونههای بیولوژیکی را معمولاً به وسیله دستگاه سانتریفوژ جدا میکنند. انواع دستگاههای سانتریفوژ برای مصارف گوناگون ساخته شدهاست. نمونههای خانگی این دستگاه برای جداکردن آب از مواد بکار میرود. در آزمایشگاه های تشخیصی از دستگاه سانتریفوژ معمولا برای جداکردن
گلبولهای خون از
پلاسما استفاده میشود.
ELISA
روش الایزا (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) یا ایمونوآسی، یک تکنیک بیوشیمیایی است که در تحقیقات ایمونولوژی به منظور بررسی وجود یک آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه های بیولوژیک مورد استفاده قرار میگیرد. الایزا یک روش تشخیصی مهم در پزشکی و پاتولوژی گیاهی محسوب میشود. همچنین از روش الایزا در بخش کنترل کیفیت در بسیاری از صنایع استفاده میشود.
در روش الایزا آنتی ژن مورد مطالعه بر سطح یک میکروپلیت تثبیت میشود. سپس آنتی ژن اختصاصی به میکروپلیت افزوده میگردد. در این مرحله اتصال آنتی بادی به آنتی ژن انجام میشود. آنتی بادی به یک آنزیم متصل است، بنابر این افزودن سوبسترای آنزیم به میکروپلیت، منجر به یک واکنش رنگی میشود. شدت رنگ حاصل متناسب با غلظت آنتی بادی یا به عبارت بهتر متناسب با غلظت آنتی ژن در نمونه مورد مطالعه است. با استفاده از روش اسپکتروفتومتری، میتوان میزان جذب نوری محلول را اندازه گیری کرد و غلظت آنتی ژن را محاسبه نمود.
استخراج و تخلیص پروتئین
خالص سازی پروتئین شامل یک سری مراحل میباشد که برای مجزا کردن یک نوع پروتئین از پروتئینهای مختلط استفاده میشود. خالص سازی امری حیاتی برای توصیف وظیفه، ساختار و فعل و انفعالات پروتئین مورد نظر میباشد. این کار معمولا با یک نمونه بافت و یا کشت میکروبی آغاز میشود. در اولین مرحله با استفاده از روشهایی نظیر سونیکاسیون، سلولها کاملا متلاشی میشوند. سپس با روش سانتریفوژ، مولکولها از قطعات سلولی جدا میشوند. محلول روئی که فاقد سلول است جدا شده و با تکنیکهای مختلفی نظیر کروماتوگرافی، Salting out و Salting in پروتئین ها از بیومولکولهای دیگر جدا میشوند. در نهایت پروتئین مورد نظر با روش Freeze drying یا خشک کردن محلول، بصورت پودر خالص تهیه میشود.
کنترل کیفیت
در مهندسی و تولید صنعتی، بخش کنترل کیفیت و مهندسی کیفیت به بخشی گفته میشود که به اصلاح روشهای تولید میپردازد، بگونه ای که کالاها از نظر مرغوبیت و رفع نیازهای مشتری ارتقاء یابند. روشهای کنترل کیفی معمولاً با همکاری رشتههای مهندسی و بازرگانی اجراء میشوند.
عمده بحث كنترل كيفيت مربوط به انجام نمونه گيري از محصولات ، بازرسي آن نمونه ها و تعميم نتايج به كل انباشت محصول است كه بر اساس روش هاي آماري انجام مي گيرد . از ديگر روش هاي مورد استفاده در كنترل كيفيت ، كنترل فرايند توليد محصول به جاي كنترل محصول تهيه شده است. مبحث كنترل كيفيت ، جايگاه ويژه اي در مباحث نظام هاي جامع مديريت كيفيت دارد.
اگر قرار باشد یک محصول، مشخصات مورد نظر مشتری را دارا باشد، پس این محصول باید به وسیله یک فرآیند پایدار یا تکرار پذیر همراه با کاهش تغییرات در فرآیند ها، تولید گردد.
تلاش برای کاهش تغییرات در فرآیندها، با هدف کاهش قیمت تمام شده و افزایش سود صورت میگیرد، چرا که با کاهش تغییرات، فرآیند شناخته تر شده و قابل کنترل تر خواهد شد. افزایش شناخت، منجر به برنامه ریزی دقیقتر شده و افزایش قدرت کنترل فرآیند، باعث کاهش ضایعات می شود.
آشنایی با پایگاه های اطلاع رسانی در اینترنت
در سالهای اخیر پیشرفتهای وسیعی در روشهای اطلاع رسانی، حاصل شده است. مخصوصا در زمینه های نرم افزاری و اینترنت. وجود پایگاه های اطلاعاتی تخصصی، دسترسی به منابع علمی را تسهیل نموده است. از جمله میتوان منابع زیر را نام برد:
1. پایگاه NCBI (National Center for Biotechnology Information)
2. KEGG: معرفی مسیرهای متابولیک در موجودات زنده مختلف
3. BioMedNet: حاوی مطالب پزشکی و زیست شناسی
4. PubMed: دارای مقالات ومنابع علمی در زمینه علوم پزشکی
و همچنین سایتهای وزارتخانه ها، دانشگاهها و مراکز تحقیقاتی
DNA microarray
در اين روش، يك زنجيره DNA با توالي دلخواه طراحي و رشته مكمل آن نيز ساخته و پس از فعال شدن بر روي نانوذرات طلا نشانده مي شود. همچنين رشته DNA ديگري كه مكمل بخشي از DNA هدف است پس از فعال شدن روي نانوذره طلا تثبيت مي شوند. سپس اجازه هيبريد شدن رشته بار كد با DNA مكمل داده مي شود. از طرفي رشته سوم DNA كه مكمل بخش ديگري از DNA هدف است پس از فعال شدن بر روي ذرات مغتاطيسي تثبيت مي شود با قرار گرفتن اين دو ذره در محلول اگر DNA هدف وجود داشته باشد حتي در مقادير بسيار اندك موجب اتصال اين دو ذره به يكديگر مي شود. در مرحله بعد با توجه به خاصيت مغناطيسي ذره دوم مي توان آنها را از محلول جدا كرد و با استفاده از عواملي ،چون تركيبات دناتوره كننده، كه دو رشته DNA را جدا مي كند DNA بار كد را از مكمل آن جدا و شناسايي مي كند. حتي ميتوان از تركيباتي مثل نقره كه حساسيت تشخيص را بالا مي برند استفاده نمود. به اين ترتيب مقادير بسيار اندك از يك توالي DNA بدون نياز به پي سي آر قابل شناسايي و حتي اندازه گيري است.
مهندسی ژنتیک
مهندسی ژنتیک، به مجموعه روشهایی گفته می شود که به منظور جداسازی، خالص سازی، وارد کردن و بیان یک
ژن خاص در یک میزبان بکار میرود و نهایتا منجر به بروز یک صفت خاص و یا تولید محصول مورد نظر در جاندار میزبان میشود. این علم کاربردهای زیادی در
علوم پایه، تولیدات صنعتی،
کشاورزی و
علوم پزشکی دارد. در زمینه علوم پایه، بررسی مکانیزمهای
همانند سازی DNA و بیان ژنها در
پروکاریوتها،
یوکاریوتها و
ویروسها و همچنین نحوه ساخته شدن و تغییر در پروتئینها و همچنین مکانیزم ایجاد
سرطان مطرح است. در زمینه کشاورزی تولید گیاهان مقاوم به آفات و خشکی، تولید گیاهان پرمحصول و تولید گاوهای دارای شیر و گوشت بیشتر، را میتوان نام برد. و در زمینه کاربردهای پزشکی، تشخیص بیماریهای ارثی، تولید انسولین انسانی، تولید هورمون رشد انسان و… را میتوان نام برد. در سالهای اخیر گسترش و توسعهٔ تکنیکهای
سنتز DNA نوترکیب انقلابی را در درمان بسیاری از بیماریهای انسانی از جمله انواع
سرطانها، اغلب بیماریهای
خود ایمنی نظیر
دیابت و همچنین تشخیص، پیشگیری و درمان بسیاری از بیماریهای مادر زادی فراهم آوردهاست.مثال معروفی از کاربرد مهندسی ژنتیک، تولید
سویه ای از
باکتری اشرشیاکلی است که قادر به سنتز انسولین انسانی است.
مهندسی ژنتیک بطور خلاصه شامل مراحل زیر است
1. انتخاب ژن مورد نظر
2. جداسازی ژن مورد نظر
3. وارد کردن ژن مورد نظر در
حامل
4. تکثیر ژن در میزبان مناسب
5. انتقال حامل ژن به سلول هدف
6. تکثیر سلول هدف
7. تولید انبوه محصول یا ایجاد صفت مورد نظر
بیوتکنولوژی
واژه بیوتکنولوژی نخستین بار در سال ۱۹۱۹ از سوی Karl Ereky به مفهوم کاربرد علوم زیستی در فناوریهای ساخت بشر به کار برده شد. به طور کلی هر گونه کنش هوشمندانه بشر در آفرینش، بهبود و عرضه فرآوردههای گوناگون با استفاده از جانداران، به ویژه از طریق دستکاری آنها در سطح مولکولی در بیوتکنولوژی، قرار میگیرد. زیستفناوری را بطور کلی، به کارگیری موجودات زنده یا فرایندهای زیستی، در صنایع تولیدی یا خدماتی تعریف کرده اند که شامل کاربرد زیستشیمی ، میکروبشناسی و فناوریهای تولید در سامانههای زیستی است. بیوتکنولوژی به لحاظ ویژگیهای ذاتی خود دانشی بین رشتهای است. بیوتکنولوژی در اصل هستهای مرکزی تحقیقات زیستی محسوب میشود و شامل دو بخش است. یک بخش در پی دستیابی به بهترین کاتالیزور برای یک فرایند یا عملکرد ویژه است و بخش دیگر سامانه یا واکنشگری است که کاتالیزورها در آن عمل میکنند.
تامین سلامت و بهداشت جمعیت بیش از شش میلیاردی ساکنان کره زمین از طریق تولید داروهای نوترکیب و واکسنها، دستیابی به روشهای درمان کمهزینه بیماریها و یافتن درمان بیماریهای بدون درمان و تشخیص سریعتر و مؤثرتر بیماریهای گوناگون از جمله بیماریهای ژنتیکی از وظایف بیوتکنولوژی پزشکی است.
همچنین رویکرد جدید به محیط زیست در قرن حاضر و در نظر گرفتن آن به عنوان یک جزء از سرمایه ملی کشورها و لزوم حفظ آن با بکارگیری زیستفناوری از مهمترین دغدغههای بشر در سده حاضر است. حذف مؤثر آلایندههای محیطی خطرناک از محیط زیست با استفاده از میکروارگانیسمهای پالایشگر آلودگی و استفاده از فنون نگهداری ذخایر ژنتیکی کشور از جمله کاربردهای زیستفناوری در زمینه محیط زیست است. کاربردهای زیستفناوری در صنعت که به تولید محصولات با صرف هزینه و انرژی کمتر، ضایعات اندک میانجامد و از همه مهمتر، کمترین اثر سوء بر محیط زیست را برجا میگذارد، باعث شد که از این فناوری به عنوان یکی از پاکترین بخشهای صنعت یاد شود. زیستفناوری همچنین تولید محصولاتی که قبلأ از روشهای دیگر امکان تولید آن وجود نداشته یا بسیار سخت و دشوار بوده است، ممکن ساخته است
Recombinant DNA
DNAی نوترکیب (Recombinant DNA)، نوعی DNA است که بطور طبیعی وجود ندارد و با متصل کردن قطعات DNAی مختلف بدست می آید. بدین منظور توالی DNAی مورد نظر به یک حامل متصل میشود. این حامل ممکن است ژنوم باکتری، یک پلاسمید یا ژنوم یک ویروس باشد. سپس DNAی نوترکیب وارد سلولهای هدف میشود. این سلولها معمولا باکتری هستند. بدین ترتیب، DNAی نوترکیب وارد مجموعه ژنتیکی میزبان میشود. با القاء کردن بیان ژنها در DNAی نوترکیب میتوان محصول پروتئینی مورد نظر را به میزان زیاد تهیه کرد. انسولین، واکسنهای نوترکیب و بعضی از پروتئینهای غذائی با این روش تولید شده اند.
تکنولوژی نوترکیبی DNAبا کشف آنزیمهای محدودالاثر (Restriction Enzymes) امکان پذیر گشته است. این آنزیمها توسط Werner Arber ، Daniel Nathansو Hamilton Smithکشف شدند و بهمین دلیل در سال 1978 جایزه نوبل به آنها اعطا گردید.
RNAi
RNA interference یا به اختصار RNAi ، سیستمی در موجودات زنده است که میزان و نحوه فعالیت ژنها را کنترل میکند. دو نوع RNAی کوچک در این فرآیند نقش دارند: miRNA و siRNA.
این بیومولکولها قادر به اتصال به RNA های خاص دیگری هستند و فعالیت آنها را افزایش یا کاهش میدهند. مثلا میتوانند مانع از تولید پروتئین توسط RNA شوند. RNAi نقش مهمی در دفاع سلولی در مقابل ژنهای پارازیتها (مثل ویروسها و ترانسپوزونها) دارد. RNAi همچنین در تکامل جنینی و بیان ژنها نقش دارد. در آینده RNAi کاربردهای وسیعی در پزشکی خواهد داشت. مثلا در کاهش فعالیت ژنها و خاموش کردن آنها توسط داروهای آنتی ویروس، میکروب کشهای موضعی، درمان عفونت با هرپس سیمپلکس، مقابله با سرطان، هپاتیت A، هپاتیت B، مقابله با HIV و آنفلوانزا.
تخلیص DNA
نقطهِ شروع بسياري از روشهاي بيولوژي مولكولي، جداسازي DNA با درجه خلوص بالا است. بدین منظورDNA ی تخلیص شده باید عاری از RNA، پروتئين، ليپيد و ساير بیومولکولهایی باشد که براي آنزيمهاي محدودالاثر و پليمرازها مزاحمت ايجاد ميكنند. بهعلت بزرگ بودن اندازهِ DNA ژنومي در پستانداران، روشهاي استخراج DNA بايد حداقل استرس مكانيكي را در طي مراحل تخلیص ايجاد نمايد. معمولا در طی استخراج DNA از چند نوع دترجنت همچونSDS وTritonX100 استفاده ميشود، كه نقش آنها ليز نمودن سلول و كمك به از بين بردن پروتئين متصل بهDNA ميباشد. پروتئينزدائي بيشتر توسط پروتيئنازK صورت ميگيرد. اين آنزيم در حضورSDS در دماي 56 تا 65 درجه فعاليت دارد تحت اين شرايط پروتئين بهتر واسرشته ميشود. متعاقب استفاده از پروتيئنازK از ايزوپروپانول براي از بين بردن موثر پروتئينها استفاده ميشود. باقيمانده پروتئينها و ليپيدها نيز توسط فنل و كلروفرم از بين ميروند. آلودگي به RNA از طريق تيمار كردن نمونه با RNAase از بين ميرود. در روشهاي ديگر، بعد از پروتئينازK از محلولهای نمكی اشباع براي رفع آلودگي به پروتئينها استفاده ميشود در استخراجDNA برايPCR بهتر است از هپارين استفاده نشود. چون هپارين از فعاليتTaq پليمراز جلوگيري ميكند .لازم به ذکر است که محلولEDTA با غلظت دومولار باعث ميشود كه كوآنزيمهاي DNase شلات شوند و از تجزيه تصادفيDNA جلوگيري گردد.
PCR
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده میکردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند. از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR (واکنشهای زنجیره ای پلیمراز) در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده میشود. در این روش با استفاده از تغییرات حرارت میتوان فرآیند تکثیر DNA را بدفعات انجام داد. امروزه این تکنیک به عنوان یک روش قدرتمند در تشخیص بالینی برای بررسی وجود
موتاسیون در ژنوم انسانی، یا برای وارد کردن جهشهای ویژه به داخل ژنها استفاده میشود.
PCR بطور خلاصه شامل 3 مرحله اصلی است:
1. مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاه قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت میدهند تا دو زنجیره DNA از هم باز شود.
مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 – 18 باز آلی تشکیل میشوند و میتوانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار میگیرند، اتصال یابند. قطعهای که به تعداد زیاد ساخته میشود، ما بین دو پرایمر ساخته میشود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30 ثانیه در دمای 65 – 30 درجه سانتیگراد صورت میگیرد.
مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمراز بر روی رشته DNA الگو، سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفاتهایی که در محلول وجود دارند، صورت میگیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.
Chemiluminescence
کمی لومینسانس عبارتست از تشعشع نور و مقدار مشخصی از حرارت، در طی یک فرآیند شیمیایی:
[A] + [B] → [◊] → [Products] +
light
بعنوان مثال واکنش لومینول با پراکسید هیدروژن در حضور کاتالیزور مناسب:
luminol + H2O2 → 3-APA[◊] → 3-APA + light
در طی این فرآیند، آمینوفتالات تولید میشود که یک مولکول فعال است. این مولکول با از دست دادن انرژی، از خود نور منتشر میکند. شدت نور حاصل با دستگاه مخصوصی اندازه گیری و بررسی میشود. در آزمایشگاههای تحقیقاتی از این فرآیند برای بررسی وجود ترکیبات خاص و یا تعیین غلضت مواد استفاده میشود.
نانوتکنولوژی
فناوری نانو یا نانوتکنولوژی، شاخه ای از دانشهای کاربردی و فناوری است که موضوعات گستردهای را پوشش میدهد. موضوع اصلی آن نیز مهار ماده یا دستگاهها در ابعاد کمتر از یک میکرومتر، معمولاً حدود ۱ تا ۱۰۰ نانومتر است. در واقع نانوفناوری فهم و به کارگیری خواص جدیدی از مواد و سیستمها در این ابعاد است، که اثرات فیزیکی جدیدی (عمدتا متاثر از غلبه خواص کوانتومی بر خواص کلاسیک) از خود نشان میدهند. نانوفناوری یک دانش به میانرشتهای است و به رشتههایی چون
فیزیک کاربردی،
مهندسی مواد، ابزارهای
نیم رسانا،
شیمی ابرمولکول و حتی
مهندسی مکانیک،
مهندسی برق و
مهندسی شیمی نیز مربوط میشود.
نانوبیوتکنولوژی
در طول دهه گذشته پيشرفت هاي زيادي در استفاده از روش هاي نانو جهت تشخيص مولكولي حاصل شده است و تلاش هاي بيشتر در جهت طراحي بيوحسگرها براي تشخيص دقيق، انتخابي و كاربردي مولكول هاي زيستي ميباشد. امروزه در بيوحسگرها براي تشخيص اسيدهاي نوكلئيك و پروتئينها به طور وسيعي از نانوذرات استفاده مي شود. اين ذرات به دليل دارا بودن اندازه نانو و خصوصيات فيزيكي و شيميايي قابل تغيير و تنظيم از جمله خواص الكتريكي، الكتروشيميايي، نوري و مغناطيسي، كانديداي مناسبي براي جايگزيني با ديگر مولكول هاي رنگي رايج در تشخيص مولكولي هستند. نانوذرات بعنوان نشانگر، حساسيت، سرعت و انعطاف پذيري تست هاي بيولوژيكي را جهت اندازه گيري حضور يا فعاليت مواد افزايش ميدهند. از طرفي چون با استفاده از اين ذرات، حجم كوچكي از نمونه مورد نياز است، نیاز به تكثير ماده مورد اندازه گيري را بر طرف ميكند. امتياز ديگر نانوذرات، قدرت تشخيص ميكروارگانيسم ها، بافت هاي سرطاني هم در داخل بدن و هم در محیط آزمايشگاهي است.
بلاتینگ
در بیولوژی مولکولی و ژنتیک، روش بلاتینگ عباتست از انتقال پروتئین، DNA یا RNA به یک پایه خاص نظیر نیتروسلولز، نایلون یا PVDF. در بسیاری از تحقیقات، این روش پس از الکتروفورز مورد استفاده قرار میگیرد. با تکنیک بلاتینگ، مولکولها از ژل به پایه مورد نظر منتقل میشوند. در مرحله بعد شناسایی مولکولها با استفاده از روشهای رنگ آمیزی انجام میشود. روش رنگ آمیزی نقره برای پروتئینها، اتورادیوگرافی برای مواد رادیواکتیو، آنتی بادی برای مولکولهای خاص و یا کمی لومینسانس، از جمله روشهای مرسوم در بلاتینگ هستند.
بر اساس نوع مولکولهای مورد مطالعه، بلاتینگ به روشهای زیر تقسیم میشود:
1. Southern blot برای DNA
2. Southwestern blot برای کمپلکس DNA و پروتئین
3. Northern blot برای RNA
4. Reverse Northern blot برای RNA
5. Western blot برای پروتئینها
6. Far-Western blot برای کمپلکس پروتئین -پروتئین
7. Eastern blotting برای تغییرات پس از ترجمه
8. Far-Eastern blot برای چربیها، داروها و هورمونها
