دزآزما

(برگرفته از تحقیقات سرکار خانم فخرالملوک رضوی)

جمع آوری مطالب: محسن بلالی، محمد قاسمی آهنگرانی (دانشجویان رشته علوم آزمایشگاهی)

سرطان پستان مهمترین عامل مرگ و میر ناشی از سرطان در زنان بوده و در حدود 33 درصد کل سرطان ها در زنان را تشکیل می دهد. با توجه به این که بیش از یک سوم زنان مبتلا به سرطان پستان در مرحله پیشرفته این بیماری جهت ادامه درمان مراجعه می کنند، هدف از این بررسی تعیین روشی برای تشخیص سرطان پستان در مراحل اولیۀ آن می باشد.

مواد و روش ها:

در این پژوهش، ابتدا آنزیم خام کاتپسین D از لوکسیت ها جدا شده و سپس با کروماتوگرافی تعویض یون با DEAE-25، ابتدا اسید پروتئازها از بقیه آنزیم ها جدا شدند و سنجش میزان فعالیت آنزیم کاتپسین D و وجود بیشترین میزان فعالیت آنزیمی در ناحیه اسید پروتئازی، کروماتوگرافی حساس با سفادکس G-200 انجام شد. سپس با انطباق فراکسیون های محدوده پیک تک شارپ در ناحیه 280 نانومتر با پیک تک آنزیمی و مشاهده باند تک به روی پلی اکریل آمید جداسازی آنزیم کامل گردید. این مراحل جداسازی و سنجش فعالیت آنزیم در بیمارستان امام خمینی تهران بر روی بیماران مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم (تست کنترل) انجام گرفت. سنجش فعالیت آنزیم با استفاده از روش اصلاح شده Anson انجام شد.

یافته ها:

میانگین فعالیت آنزیم کاتپسین D در خون افراد مبتلا به سرطان پستان 56/2  42/37 و در افراد سالم (گروه شاهد) 011/1  94/11 به دست آمد که این اختلاف معنی دار می باشد (P>0.03).

استنتاج: با توجه به یافته های این پژوهش اندازه گیری آنزیم کاتپسین D به عنوان یک شاخص تشخیصی برای شناسایی زودرس افراد مبتلا به سرطان پستان می تواند مورد توجه قرار گیرد.

واژه های کلیدی: آنزیم کاتپسین D، سرطان پستان، سرطان ها.

 معرفی تومور مارکر بصورت کلی

آنزیم کاتپسین (Ec 3.4.4.23 D) یک آنزیم پروتئاز لیزوزومی و از دسته آسپارتیک پروتئازهاست. تاکنون چندان مورد توجه محققین نبوده، اما به علت اثرات فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی آن، از جمله هضم داخل سلولی پروتئین ها توسط ماکروفاژ، شکستن ماتریکس خارج سلولی غضروف و تجمع در سلولهای التهابی و افزایش میزان فعالیت آن در سرطان پستان، از اهمیت بسزایی برخوردار است.

معرفی تومورهای مربوطه بصورت کلی

سرطان پستان شایعترین سرطان در زنان می باشد و براساس آمار 33 درصد کل سرطان ها در زنان را تشکیل می دهد، به طوری که در آمریکا از هر 9 زن یک نفر مبتلا به سرطان پستان می باشد. امروزه جهت تشخیص سرطان پستان از ماموگرافی و خودآزمایی پستان استفاده می شود. مطالعه ماموگرافی در پستان های سفت یا در بیمارانی که تغییرات فیبروکیستیک پستان دارند، مشکل می باشد و نتایج مطلوبی در جهت تشخیص زودهنگام سرطان پستان ندارد. در انتها به طور کامل در مورد بحث می کنیم.

ساختار مولکولی و شیمیایی

یک گلیکوپروتئین است که ابتدا ترجمه شده و به نوعی با kdsz گلیکوزیده می شود که بعداً طی یک مرحله به وزن مولکولی kd48 می رسد. به عنوان مارکر فعالیت استروژن به صورت یک عامل رشد از طریق گیرنده انسولین II عمل می کند و برای پیش آگهی از نظر تهاجم و متاستاز، تومور مارکر مناسبی است.

ساختار شیمیایی و نقش بیوشیمیایی در سلول طبیعی و توموری

آنزیم کاتپسین D، یک آنزیم پروتئاز لیزوزومی است که در گروه آسپارتیک پروتئاز قرار دارد این آنزیم ابتدا به فرم پیش ساز یا پروکاتپسین D سنتز شده و این فرم پیش ساز، بعد از اسیدی شدن محیط، از فرم غیرفعال پروکاتپسین D به شکل فعال کاتپسین D تبدیل شده و باعث هضم داخل سلولی پروتئین ها توسط ماکروفاژ، شکستن ماتریکس خارج سلولی غضروف می شود. براساس نتایجی که اخیراً بوسیله محققین بدست آمده است، آزاد شدن پروتئازها به محیط خارج سلولی توسط سلولهای بدخیم، بیشتر از میزان آنها توسط سلولهای طبیعی است. در این زمینه آنزیم کاتپسین D را در سلولهای تومری بررسی کرده اند و افزایش میزان آن را در سرطان پستان و همچنین در آرتریت روماتوئید و سندرم نفروتیک نیز تأیید کرده اند. آنزیم کاتپسین (EC) D نماینده آنزیم های Carboxyl dependent class of endopeptidas است. و از کاتپسین D طحال خوک، 6 ایزوآنزیم بدست آمده است و 5 ایزوآنزیم آن (V تا I) دارای وزن ملکولی 50000= Mr دالتون و یک ایزوآنزیم آ« (HMW) دارای وزن ملکولی 100000 دالتون است که ایزوآنزیم ها از (I تا IV)، هر کدام دارای دو زنجیره پلی پپتیدی هستند:

1- یک زنجیره سنگین با 350000 = Mr

2- یک زنجیره سبک با 15000 = Mr

آنزیم کاتپسین D، توسط مهار کننده هایی مانند دی آزواستیل و نورولوسین مهار می شود. اما علاوه بر آن، دارای مهار کننده اختصاصی به نام Pepstatin است؛ به طوری که Pepstatin در غلظت M ^7-10×5 به طور کامل (100 درصد) کاتپسین D را مهار می کند. براساس مطالعات گارسیا (1996) افراد مبتلا به سرطان پستان دارای سطح بالایی از کاتپسین D هستند که به علت افزایش میزان رونویسی از ژن کاتپسین D به وسیله هورمون های استروژن و هورمون رشد در سلول های سرطانی پستان با یک مکانیزم ناشناخته است.

راجر فورد و همکاران (1996) نیز همراه با بیان افزایش میزان کاتپسین D در سرطان پستان، مطالعه ای را بر روی توالی اسیدهای آمینه در ساختمان آنزیم کاتپسین D در افراد مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم انجام دادند و مشاهده کردند که توالی اسیدهای آمینه آنزیم کاتپسین D در افراد مبتلا به سرطان پستان با افراد سالم یکسان است.

هدف از این مطالعه که برای نخستین بار در ایران انجام می شود، بررسی میزان فعالیت آنزیم کاتپسین D در لوکوسیت های خون افراد مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم است. با توجه به هزینه زیاد جهت تهیه آنزیم و ارزش کلینیکی آن، می توان به اهمیت خالص سازی آن پی برد.

روش های اندازه گیری و خالص سازی

اولین مرحله در انجام خالص سازی استخراج آنزیم خام از لوکوسیت های خون بود. در این روش، جهت جداسازی گلبول های سفید، به لوله پلاستیکی حاوی خون هپارینه به ازای هر میلی لیتر خون، 5/3 میلی لیتر دکستران اضافه گردید. بعد از مدت یک ساعت، فاز پلاسمایی حاوی گلبول های سفید را به لوله آزمایش دیگر انتقال داده و به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ گردید.

سپس رسوب را از لایه رویی جدا کرده و عمل هموژنیزاسیون (u/_min9) به مدت یک دقیقه در 5 نوبت بر روی رسوب انجام شد. گرانول ها از سایر اجزاء هسته، طی دو مرحله سانتریفوژ افتراقی جدا شدند، و سپس رسوب را از لایه رویی جدا کرده و 3 میلی لیتر بافرتریس کلراید (pH=7.8mmol) حاوی Triton x-100 جهت پاره کردن دیواره گرانول ها به رسوب اضافه شد. بعد از اضافه کردن استن سرد به محلول 75 درصد، محلول به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ گردید و بعد از عمل سانتریفوژ، رسوب از لایه رویی جدا شد. در عمل دیالیز محلول آنزیمی بر علیه بافر EDTA Tris به مدت 24 ساعت انجام شد و سپس بر علیه بافر Tris HCL برای همان مدت انجام گرفت. در مرحله دوم جداسازی، با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یون (52- DEAE) جداسازی اسید پروتئازها از بقیه اجزاء انجام شد و کروماتوگرافی بر روی ستون به ابعاد 1cm*30cm و سرعت 8/1 میلی لیتر در ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد، در فراکسیون های 4 میلی لیتر انجام گردید. هر دو مرحله جداسازی با استفاده از گرادیان پله ای، با افزایش غلظت نمک طعام، سست شدن اتصالات و خروج مرحله ای مواد از ستون انجام شد.

در مرحله اول، با غلظت نمک 35 میلی مولار، Neutral proteases جدا شدند و سپس با افزایش غلظت نمک، در غلظت یک دهم نرمال اسیدپروتئازها از بقیه اجزاء جدا شدند.

پیک دو شاخه اسید پروتئازی بر روی رکوردر ثبت شد و سنجش فعالیت آنزیم بر روی فراکسیون حاصل از این کروماتوگرافی انجام گردید و منحنی مربوط به آن رسم شد. سپس کروماتوگرافی بسیار حساستری با سفادکس 200-G بر روی ستون به ابعاد 106cm*60cm به مدت 48 ساعت با سرعت 8/1 میلی لیتر در ساعت انجام شد. با انطباق فراکسیون های محدوده پیک تک شارپ در ناحیه 280 نانومتر با منحنی آنزیم، وجود پیک تک فعالیت آنزیم کاتپسین D در محدوده پیک تک شارپ، دلیل بر خلوص و جداسازی کامل آنزیم بود.

در مرحله بررسی میزان فعالیت آنزیم، سنجش فعالیت آنزیم با استفاده از روش اصلاح شده Anson که دارای حساسیت ng300 آنزیم بود، بر روی هموگلوبین به عنوان سوبسترای کاتپسین D انجام شد. pH محیط 1/1 و دمای محیط آزمایش 38 درجه سانتی گراد بود.

این مراحل جداسازی و سنجش فعالیت آنزیم بر روی 8 بیمار مبتلا به سرطان پستان و 8 فرد سالم (تست کنترل) انجام شد.

 یافته ها

در این مطالعه که به منظور مقایسه میزان فعالیت آنزیم کاتپسین D در زنان مبتلا به سرطان پستان با زنان سالم صورت گرفت، هشت بیمار مبتلا به سرطان پستان و هشت فرد سالم به عنوان گروه کنترل مورد بررسی قرار گرفتند. میانگین سن گروه بیمار 37/40 (با انحراف معیار 8/5) میانگین سن گروه کنترل 25/39 (با انحراف معیار 172/8) بود. آزمون آماری t تفاوت معنی داری را از نظر سنی بین دو گروه نشان نداد. نتایج به دست آمده در مورد اندازه گیری آنزیم کاتپسین D نشان داد که فعالیت این آنزیم در افراد مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم (کنترل) افزایش بیشتری دارد.

منابع

ـ خالص سازی آنزیم کاتپسین D از لوکوسیت های انسان و بررسی آن. فخرالملوک رضوی، دکتر ناصر ملک نیا،   دکتر بیژن فرزامی

ـ بررسی میزان فعالیت آنزیم کاتپسین D در بیماران مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم. فخرالملوک رضوی، دکتر ناصر ملک نیا، دکتر بیژن فرزامی

 – Garcia M, Platet N, Liaudet E. Biological and clinical significant of cathepsin K in breast cancer tem-cells. 1996; 14(6): 642-50.

– Lipponen PK. Expression of cathepsin D in transitional cell bladder tumours. J. Pathol 1996; 178(1): 59-64.