دزآزما

فاطمه میرزائی فینی، فرزین شیخ (علوم آزمایشگاهی)

p53 پروتئيني است كه در ارتباط با DNA بوده و بنام سركوبگر تومور (Tumor suppressor ) ناميده شده و در انسان توسط ژن TP53 كد مي شود . وجود اين پروتئين در ارگانيسم هاي پر سلولي حياتي بوده و تنظيم كننده سيكل سلولي است و عملكرد آن به عنوان سركوبگر تومور به معناي جلوگيري كننده از بروز سرطان مي باشد . از P53 به عنوان محافظ ژنوم يا نوك پيكان حفاظت از ژن يا رئيس ديده بانهاي ژنوم نامبرده مي شود كه همگي آنها بيانگر نقش حفاظتي آن در جلوگيري از موتاسيونهاي ژنوم مي باشد.

نام P53 برگرفته از توده مولكولي آن مي باشد كه بر روي ) SDS-PAGE) ( سديم دو دسيل سولفات پلي آكريل آميد ژل الكتروفورز ) به صورت يك پروتئين 53  كيلو دالتوني جدا مي شود. اما اگر بر اساس تعداد اسيدهاي آمينه آن شناسايي صورت بگيرد 43.7 كيلو دالتون خواهد بود اين تفاوت به دليل تعداد زيادي اسيدهاي آمينه اطراف مولكول آن ميباشد كه در حركت الكتروفورتيك سنگين تر از حالت طبيعي خود را نشان مي دهد. اين حالت در P53 گونه هاي مختلف شامل انسان ‌‌‌‍، جوندگان، قورباغه و ماهيها ديده مي شود.

 پروتئين هاي نگهبان ژنوم به دو دسته كلي تقسيم مي شوند:

 الف: نگهبان دروازه سلولي (Gate keeper  ):

 اينها برروي سيكل سلولي عملكرد دارند و چنانچه سلول هنگام تقسيم سلولي دچار مشكل شود وارد عمل شده و از ورود سلول به مرحله بعدي تقسيم جلوگيري مي كنند چنانچه مشكل به وجود آمده قابل برطرف شدن باشد تقسيم سلول تا برطرف شدن آن متوقف مي شود و چنانچه مشكل قابل حل نباشد سلول موتاسيون پيدا كرده محكوم به فنا است . بنابراين از به وجود آمدن سلول سرطاني و موتاسيون يافته در سيكل سلولي جلوگيري خواهد شد.

ب: Tumor suppressor ها :

يا پروتئينهاي سركوبگر كه نقش حفاظتي و ترميمي ژنوم را به عهده دارند در هنگام همانند سازي از روي DNA  چنانچه موتاسيوني اتفاق بيفتد وارد عمل مي شوند و باز تا برطرف شدن نقص به وجود آمده كليه فعاليتهاي همانند سازي متوقف مي شود.

سيكل سلولي شامل مراحلي است كه سلول در آن آمادگي پيدا مي كند تا تقسيم انجام دهد اين تقسيم مي تواند ميتوز يا ميوز باشد. لازمه تقسيم در سلول ورود به مراحل مختلف است سلول در حالت استراحت در فاز G1 به سر مي برد. هنگاميكه مي خواهد تقسيم انجام شود از فاز G1 وارد فاز S مي شود ، در فاز S همانند سازي كليهْ مواد حياتي سلول صورت مي گيرد سپس سلول وارد فاز G2 مي شود در اين فاز يك استراحت كوتاهي انجام مي شود و همانند سازي بعضي ازپروتئين هاي مورد نياز سلول انجام مي شودسپس سلول وارد فاز M يا تقسيم مي شود.

سلولهايي كه به هيچ وجه تقسيم نمي شوند وارد فاز G0 مي شوند مثل سلولهاي عصبي . بيشترين زمان را سلول در فاز G1 بسر مي برد.

مرحله ورود به هر فاز از سيكل سلولي مرحله بسيار مهمي است. و بايد سلول مورد ارزيابي ژنوميك قرار بگيرد به نقاط ورود به هر فاز نقاط Check point  گفته مي شوند، كه اين چك كردن به عهدهْGate keeper  ها است و بين اين فازها تومور سابرسورها فعال هستند.

ژن P53: در انسان P53 توسط ژن TP53 كه بر روي بازوي كوچك كروموزوم 17 قرار دارد كد مي شود طول ژن 20 هزار جفت باز مي باشد كه اگزون شمارهْ 1 آن كد كننده نبوده و اولين اينترون نيز بسيار طويل و 10 هزار جفت باز طول دارد. توالي كد كننده شامل 5 ناحيه مي باشد كه اگزونهاي 2 ،5،6،7،8 اين ژن به شدت در بين گونه هاي مهره داران حفاظت شده مي باشد،يعني داراي توالي ثابت است.  

در انسان يك پلي مورفيسم شايع (تغيير توالي شايع) كه منجر به جايگزيني آرژينين به جاي پرولين در كدون 72 اين مولكول مي شودوجود دارد. مطالعات زيادي بر روي اثر اين تغيير توالي صورت گرفته كه نشان مي دهد فرد مستعد بروز بعضي از Cancer ها است. محل اين ژن در ساير پستانداران بر روي كروموزومهاي متفاوتي است براي مثال:در شامپانزه و اوران گوتان بر روي كروموزوم 17، در موش كروموزوم 11، در Rat كروموزوم 10، در سگ كروموزوم 5، درگاو كروموزوم 19 ، در اسب بر روي كروموزوم 11 .     

 ساختمان پروتئين P53 :

در انسان P53 داراي 393 اسيد آمينه و 7 دومين (Domain ) مي باشد  که شامل :  

دومين شمارهْ 1 :

يك دومين N ترمينال اسيدي مي باشد كه بنام دومين فعال كنندهْ رونويسي يا TAD نام دارد. همچنین به عنوان دومین فعال کننده 1 (AD1)  شناخته می شودکه می تواند فاکتورهای رونویسی را فعال کننده رونویسی را فعال نماید این دومین اسید آمینه های شماره 1 تا 42 را شامل می شود انتهای N ترمینال شامل دو دومین فعال کننده رونویسی می باشد که مکمل یکدیگر هستند که یکی از آنها بزرگتر و از اسید آمینه 1 تا 42 بوده و دیگری کوچکتر و از اسید آمینه 55تا 75 می باشد که به طور اختصاصی در تنظیم چند ژن پروآپپتوتیک دخالت دارند.

دومين شمارهْ : 2

دومين فعال كنندهْ شمارهْ 2 يا AD2 كه نقش مهمي در فعال كردن آپپتوز دارد و از اسید آمینه 43 تا 63 را شامل می شود .

دومين شمارهْ 3 :

دومين غنی از پرولين كه نقش مهمی در فعالیت آپپتوزی مولکول p53 دارد و از اسید آمینه 64 تا 92 را شامل می شود.

دومين شمارهْ4 :

دومين مركزي وصل شونده به DNA يا DBD كه حاوي يك اتم روي و چند اسيد آمينهْ آرژينين مي باشد و از اسید آمینه 100 تا 300 را شامل می شود این ناحیه مسؤل اتصال مولکول LMO3 می باشد که کمک کننده به مهار (کورپرسور) p53 است .

دومين شمارهْ 5:

دومين سيگنال دهنده هسته ایی که از اسید آمینه شماره 316 تا 325 را شامل می شود.

دومين شمارهْ 6 :

دومين اوليگومر كننده(OD) که از اسی آمینه 307 تا 355 را شامل می شود  و ايجاد حالت تترامريزه شدن در مولكول P53 ( 4 رشته اي ) را مي كند كه براي ايفاي نقش آن در داخل بدن بسيار حياتي است.

دومين شمارهْ 7 :

دومين C ترمينال كه در کاهش اتصال دومين مرکزی متصل شونده به DNA دخالت داردو از اسید های آمینه 356 تا 393 را شامل می شود.

یک دومین 9 اسیدآمینه ایی تکراری بنام 9aaTAD در ناحیه AD1 و AD2 مولکول p53 شناسایی شده است این دومین واسطه واکنش بین مولکول p53 و تقویت کننده های عمومی فعالیت مولکولی (general co activator) شاملTAF,CBP/p300, GCN5, PC4 و همچنین واسطه بین پروتیین تنظیم کننده(MDM2) و پروتیین عامل تکثیر (Replication protein) می باشد.

جهشهاي غير فعال كنندهْ P53 در Cancer ها معمولا‌َ در دومين BDB صورت مي گيرد. در واقع بيشتر جهشها توانايي چسبيدن پروتئين به DNA را از بين مي برد و بنابراين باعث مهار اثر فعال كنندگي فاكتورهاي رونويسي اين مولكول مي شود.

اين جهشها معمولاُ به شكل اتوزوم مغلوب هستند و از طرفي باعث اتصال مولكول معيوب به مولكول سالم P53 نيز مي شوند كه اين باعث مهار عملكرد مولكولهاي سالم P53 در سلول مي شود.

 عملكرد P53 :

P53 داراي مكانيسمهاي ضد سرطاني زيادي مي باشد همچنين در آپپتوز، در پايداري ژنوم و جلوگيري از فعاليتهاي رگزايي نقش دارد. به عنوان عملكرد ضد سرطاني از مكانيسم هاي زير استفاده مي كند:

1 – ميتواند پروتئينهاي ترميم كنندهْ DNA را در مواردي كهDNA آسيب ديده تشخيص داده مي شود فعال نمايد.

2 –با متوقف كردن چرخهْ سلولي در نقطهْ G1/S مانع رشد سلول شده تا آسيب تشخيص داده شده بر روي DNA ترميم شود، بعد از ترميم آسيب ، مهارسلول برداشته مي شود و سلول ادامهْ چرخهْ خود را انجام مي دهد.

3 – آپپتوز را ميتواند شروع نمايد ، آپپتوز مرگ برنامه ريزي شدهْ سلول است در حالتيكه آسيب DNA غير قابل ترميم باشد آپپتوز شروع خواهد شد.

مكانيسم عملكرد به اين صورت است كه :

در حالت طبيعي P53 به مولكول mdm2 متصل بوده و غير فعال مي باشد به محض ايجاد آسيب DNA يا استرسهاي سلولي دو حالت اتفاق مي افتد.

الف: مهار P53 برداشته مي شودو P53 فعال مي گردد.

ب: ميزان توليد P53 در سلول افزايش مي يابد.

P53 فعال شده بهDNA وصل مي شودو باعث افزايش بيان چند ژن شامل WAF1/CIP1 مي شود كه مولكول P21 را كد مي كنند.

P21 در فاز G1/S به CDK2 (Cycling Depended Kinas 2) متصل مي شود و باعث مهار آن مي گردد.

كمپلكس CDK2 براي ادامهْ روند چرخهْ سلولي بسيار مهم مي باشد،و وقتي كه P21 به آن متصل شد سلول نمي تواند وارد مرحلهْ بعدي تقسيم خود شود .

P53 جهش يافته نمي تواند براي مدت طولاني به DNA وصل شود و در نتيجه P21 نيز به مقدار كافي در دسترس نخواهد بود تا سيگنال توقف تقسيم سلولي را ايجاد نمايد، و سلول به صورت غير قابل كنترل تقسيم خواهد شد و نتيجهْ آن ايجاد تومور خواهد بود. تحقيقات اخير اتصال مولكول P53 را به مولكول ديگري بنام RB1 از طريق واسطه اي بنام14 P جهت مهار سيكل سلولي نشان داده است.

بيان P53 را ميتوان به وسيلهْ قرار دادن سلول در معرض اشعهْ U.V بررسي نمود. در اين حالت اشعهْ U.V باعث آسيب DNA شده و مقدار p53 در سلول افزايش مي يابد.

 تنظيم نمودن مقدار P53 :

P53 ميتواند در پاسخ به استرسهاي سلولي فعال گردد. اين استرسها شامل آسيب DNA به وسيلهْ اشعهْ U.V يا اشعهْ مادون قرمز يا مواد شيميايي مثل پراكسيد هيدروژن ميباشد،ويا استرسهاي اكسيداتيو مثل هيپوكسي يا شوك اسمزي يا اتمام ذخيرهْ ريبونوكلئوتيدي سلول و يا بيان كنترل نشدهْ اونكوژنهاي سلول ( ژنهاي سرطان زايي سلول) . اين فعال شدن به وسيلهْ دو اتفاق عمده مشخص مي شود:

الف: نيمه عمر مولكول P53 افزايش مي يابد كه منجر به تجمع سريع P53 در سلول استرس ديده، مي شود.

ب: تغئير شكل فضايي كه منجر به قويتر شدن P53 در فعال كردن تنظيم كننده هاي رونويسي در سلول آسيب ديده مي شوند.

مهمترين اتفاق در فعال كردن P53 ، فسفريله شدن دومين N ترمينال آن مي باشدكه منجر به فعال كردن يكسري از پروتئين كينازها خواهد شد. اين پروتئين كينازها به دو گروه تقسيم مي شوند:

1-يك گروه آنهايي هستند كه متعلق به خانواده NAPK مثل (JNK1-3 و ERK1-2 وP38MAPK) مي باشند كه در تعدادي از انواع استرسهاي سلولي مثل آسيب غشاء سلولي ، آسيبهاي اكسيداتيو ، شوك اسمزي ، شوكهاي حرارتي و….. فعاليت مي كنند.

2-گروه دوم پروتئين كينازها شامل (ATM،ATR،CHK1،CHK2،DNA-PK،CAK)

مي باشند كه در يكنواختي و اتصال ژنوم دخالت دارندو به صورت يك آبشار مولكولي در آسيب هاي DNA كه بوسيلهْ مواد ژنوتوكسيك ايجاد مي شود فعاليت مي نمايند.انكوژنها نيز P53 را با واسطهْ پروتئين P14 فعال مي نمايند. در سلولي كه تحت استرس نباشد مقدارP53 به وسيلهْ تخريب پيوستهْ آن پائين نگه داشته مي شود. يك پروتئيني بنام mdm2 كه در انسان HDM2 نيز ناميده مي شودكه خود از P53 توليد مي شود به مولكول P53 متصل مي شود واز فعاليت آن و همچنين از حركت آن از هسته به سيتوپلاسم جلوگيري مي كند. همچنين mdm2 باعث فعال شدن يو بي كو اي تين ليگاز مي شود كه يو بي كو اي تين را به صورت پيوند كووالان به مولكول P53 متصل كرده و باعث تخريب آن در مجموعهْ پروتئازوم مي شود. يو بي كواي تيليشن P53 برگشت پذير مي باشد.

يك پروتئاز اختصاصي بنام USP7 ميتواند پيوند يوبي كواي تين و p53 را بشكند كه اين باعث افزايش مقدار p53 در سلول خواهد شد. اين حالت در پاسخ به اونكوژنهاي سلولي صورت مي گيرد.

Mdm2 باعث مي شود قسمت فسفريله شدهْ N ترمينال P53 كه منجر به فعال شدن اين مولكول شده بود را فسفريله كند. مولكولهايي مثل Pin1 منجر به تغيير شكل فضايي مولكول P53 مي شوند و عملكرد mdm2 را مهار مي كنند.

فسفريلاسيون همچنين اجازهْ اتصال به فعال كننده هاي رونويسي مانند(P300 ويا PCAF) را ميدهد كه اينها منجر به ا ستيله شدن ناحيهْ كربوكسي مولكول P53 مي شوند و اين مولكول به اين ترتيب خواهد توانست به DNA بچسبد. اين اتصال اجازه خواهد داد ژنهايي به طور اختصاصي فعال يا غير فعال شوند. آنزيم هاي داستيلاز مانند Sirt1 و Sirt7 كه ميتوانند P53 را داستيله كنند منجر به مهار آپپتوز خواهند شد. بعضي از اونكوژنها با تحريك رونويسي پروتئينهايي كه به mdm2 متصل مي شوند منجر به مهار آن شده و مانع آپپتوز خواهند شد.

توضيحاتي در مورد آپپتوز :

سلولها در مقابل عوامل محيطي يا داخلي كه منجر به از دست دادن بعضي از تواناييهاي حياتي خود مثل تكثير يا مصرف انرژي ، توليد ATP يا اتمام بعضي از مواد حياتي محيطي مانند اكسيژن ، نوكلئوتيدهايي كه براي رونويسي از DNA  لازم است، داراي مكانيسم از پيش تعريف شده اي هستند كه حاصل آن مكانيسم مرگ سلول خواهد بود. در اين خصوص برنامهْ از پيش تعيين شده اي براي مردن سلول وجود دارد كه طي اين برنامه در سلول واكنشهاي آبشاري تخريبي فعال ميشوند. اين واكنشها با تخريب ميتوكندري و ليزوزومها كه آنزيم هاي هضم سلولي در آنها قرار دارد شروع مي شود،حاصل آن هضم سلول و تجزيه شدن اجزاي مختلف آن خواهد بود كه به اين حالت مرگ از پيش تعيين شدهْ سلولي مي گويند. بايد توجه داشت آپپتوز با نكروز فرق دارد چون نكروز پروسهْ التهابي و غير طبيعي است در حاليكه آپپتوز طبيعي است و لازمهْ حيات صحيح يك سلول مي باشد.

نقش P53 در بروز بيماريها :

اگر ژن TP53 آسيب ببيند سركوب كردن تومورها بشدت كاهش خواهد يافت. افراديكه فقط يك ژن سالم و فعال TP53 را به ارث برده اند در اوايل بلوغ،تومور خواهند گرفت. همهْ ژنها دو كپي دارند: يكي مادري و يكي پدري . ژنهايي كه بصورت اتوزوم مغلوب به ارث مي رسند فعاليت يك كپي از آنها براي عملكرد صحيح سلول كافي است و چنانچه هردو كپي از ژن معيوب باشد بيماري بروز خواهد كرد. ژنهاي سركوبگر تومور و توليد كنندهْ آنزيم هاي مختلف از اين دسته اند. بعضي از ژنها كه نحوهْ وراثت آنها به صورت اتوزوم غالب مي باشد مانند انكوژنها ، اشكال در يك كپي از ژن منجر به بروز بيماري مربوطه خواهد شد. توضيح اينكه اكثر اين ژنها پروتئينهاي ساختماني سلول را مي سازند.

 يك بيماري شناخته شده در اين خصوص وجود دارد كه سندرم لي فرامني نام دارد. ژن P53 مي تواند در سلول به وسيلهْ عوامل ايجاد كنندهْ جهش (موتاژن) مانند : مواد شيميايي ، اشعه يا ويروسها آسيب ببيند در اينصورت احتمال تقسيمات كنترل نشدهْ سلولي افزايش مي يابد. بيشتر از 50% تومورهاي انساني حاوي جهش يا حذف ژن TP53 هستند. افزايش مقدار P53 بنظر مي رسد يك راه خوبي براي درمان تومور يا جلوگيري از گسترش آن باشد، اما در عمل هنوز اين روش درماني استفاده نشده است . زيرا اين كار مي تواند ايجاد پيري زودرس نمايد.

به هر حال بازگشت ذخيرهْ داخل سلولي P53 فعال، اميدهاي زيادي را به خود جلب كرده است.

از دست دادن P53 منجر به ناپايداري ژنوم مي شود و اغلب در حالتهاي آنيوپلوئيدي Aneuploidy)) ( تغيير تعداد كروموزومها ) . بعضي پاتوژنها مي توانند بر روي پروتئين P53 تآثير داشته باشند اين كار از طريق تآثير بر روي بيان TP53 صورت ميگيرد. يك مثال در اين زمينه پاپيلوما ويروس انساني(HPV) مي باشد كه پروتئيني بنام E6 را كد مي كند كه اين پروتئين مي تواند به P53 متصل شود و آنرا غير فعال نمايد.

اين پروتئين در همكاري با پروتئين ديگري بنام PRB يا پروتئين E7 كه توسط EBV توليد مي شود اجازه مي دهد تقسيمات مكرر سلولي اتفاق افتاده و بيماري كلينيكي زگيل به وجود بيايد.

بعضي از انواع HPV مانند Type 16,18 ميتوانند باعث پيشرفت زگيل به وجود آمده شده و فرمهايي از ديسپلازي سرويكس (دهانهْ رحم) را ايجاد كنند كه نوعي از آسيبهاي پيش سرطاني اين ناحيه مي باشد. عفونتهاي مقاوم سرويكس (دهانهْ رحم ) در طول سالها مي تواند ايجاد آسيبهاي برگشت ناپذير و كارسينوم آن ناحيه را ايجاد كند، كه در نهايت سرطان مهاجم سرويكس را باعث خواهد شد، اين نتيجهْ اثرات ژنهاي HPV به ويژه آنهايي كه كد كنندهْ E6 و E7 هستند ميباشد.  اين دو پروتئين انكو پروتئينهاي ويروسي مي باشند كه در نتيجهْ اتصال DNA ويروسي به DNA  ژنوميك سلول ميزبان به وجود مي آيند. در انسان سالم پروتئين P53 دائمآ توليد و تخريب مي شود. تخريب P53 همانطور كه ذكر شد ارتباط با اتصال به mdm2 دارد.

در يك چرخهْ فيدبك منفي mdm2 خودش نيز به وسيلهْ پروتئين P53 القاء مي شود. پروتئينهاي P53 جهش يافته منجر به القاء mdm2 نخواهد شد و آنها در مقادير زيادي در سلول تجمع پيدا خواهند كرد. بدتر از همه اينكه پروتئين جهش يافتهْ P53 ميتواند عملكرد نرمال  P53 را مهار كند.

 كشف P53 :

  P53 در سال 1979 به وسيلهْ Lionel Crawford و همكاران كه در دانشگاه پرينستون انگليس بر روي تومورهاي تجربي كار مي كردند كشف شد. فرضيهْ وجود چنين ژني از تآثير ويروس SV40 در ايجاد و توسعهْ تومور از قبل وجود داشت .

ژن TP53 موشي در سال 1982 توسط Peter Chamakov  كه از دانشمندان روسي بود كلون گرديد. ژن TP53 انساني در سال 1984 كلون گرديد. در سال 1992 ،  Wafik-Eldeiry  يك توالي مورد توافق(  (consensus sequenceدر ژن P53 انساني پيدا نمود كه در واكنش ايمنو پرسيپيتاسيون ژنوم انسان و پروتئينهاي P53 توليد شده توسط باكلو ويروس(Baculo virus) (نوعي ويروس حشرات ) قابل شناسايي بود. اين كشف در اولين شمارهْ ژورنال Nature Genetics  در سال 1992 چاپ گرديد ، و نتيجه گيري شد كه اين توالي ناحيهْ كنترل شدهْ ژن P53 ميباشد. در سال 1993 اين مولكول ، نام مولكول سال را به خود گرفت .

 واكنش متقابل :

P53 در سلول با ژنهاي ديگري مانند ATM: (Ataxia Telangiectasia Mutated) و      BRCA1و BRCA2 (Breast Cancer Ag 1,2) و cdk1 و cyclin H  و CREB1 و Heat shock protein   90 كيلودالتوني سيتوزولي و بسياري ژنهاي ديگر واكنش متقابل دارد.

 روشهای شناسایی پروتیین p53:

جهت شناسایی پروتیین p53 از تکنیک های ایمنولوژی با استفاده از آنتی بادی منوکلونال ضد مولکول p53 کمک گرفته می شود این مولکول برای گونه های دیگر بسیا آنتی ژنیک بوده و از این خاصیت آن جهت تهیه آنتی بادی برعلیه آن استفاده می شود و به این وسیله قابل شناسایی است ازآنجا که افزایش p53 در سلولها صورت می گیرد بنابراین جهت بررسی افزایش بیان بافتی از تکنیک ایمنوهیستوشیمی بااستفاده از منوکلونال آنتی بادی کمک می گیرند.

شناسایی جهش های ژنی p53 :

همانطور که در متن اشاره گردید در بسیاری از سرطان ها بوجود آمدن جهش در ژن p53 عامل پشیرفت سرطان می باشد بنابراین برای شناسایی این جهش ها از تکنیک های مولکولی مثل PCR با استفاده از پرایمر مخصوص این ژن و مقایسه آن با ژن طبیعی کمک گرفته می شود

 منابع:

  1-      Piskacek S, Gregor M, Nemethova M, Grabner M, Kovarik P, Piskacek M (June 2007). “Nine-amino-acid transactivation domain: establishment and prediction utilities”. Genomics 89 (6): 756–68

2-      Cui R, Widlund HR, Feige E, Lin JY, Wilensky DL, Igras VE, D’Orazio J, Fung CY, Schanbacher CF, Granter SR, Fisher DE (2007). “Central role of p53 in the suntan response and pathologic hyperpigmentation”. Cell 128 (5): 853–64.

3-      Vakhrusheva O, Smolka C, Gajawada P, Kostin S, Boettger T, Kubin T, Braun T, Bober (March 2008). “Sirt7 increases stress resistance of cardiomyocytes and prevents apoptosis and inflammatory cardiomyopathy in mice”. Circ. Res. 102 (6): 703–10