علیرضا مبهوت، رشته پزشکی
Oligonucleotide ها که غالباً پرایمر خوانده میشوند نوکلوئیک اسیدهای کوتاه و تک رشتهای هستند که از DNA و RNA به منظور اتصال به رشته مکمل خود سنتز میشوند. پرایمرها یک مکان هدف دارند که آن مکان به عنوان نقطه آغاز پلیمراز عمل کرده و پلیمراز آن نقطه را شناسایی کرده و با استفاده از قطعات DNA به گسترش زنجیره میپردازد.
DNA شامل دو رشته استاندارد میباشد که یکی از آنها sense و دیگری anti sense نامیده میشود. این دو رشته مکمل یکدیگرند. در طول PCR باندهای هیدروژنی شکسته میشوند و دو رشته از هم جدا میشوند. این عمل به پرایمر اجازه میدهد تا به منطقه هدف DNA متصل شود. یک پرایمر به رشته استاندارد sense متصل میشود و پرایمر دیگر به رشته anti sense اتصال مییابد.
وقتی که پرایمرها برای PCR طراحی میشوند باید یک سری ملاحضات در نظر گرفته شود از جمله: تعداد پرایمرهای مورد نیاز، طول پرایمرها، انتهای 3’ و 5’، جهش در پرایمر، دمای ذوب پرایمر، تعداد نوکلئوتیدهای G-C و فاصله میان رفت و برگشت پرایمرها.
بيوانفورماتيك روشي علمي است که تكنولوژي اطلاعات را در جهت سازمان دهي، تحليل و تعميم اطلاعات زيستي در راستاي پاسخ به مجموعه اي از سؤالات زيستي بكار مي گيرد. بيوانفورماتيك همچنين شامل جمع آوري، سازماندهي، ذخيره سازي و بازيافت اطلاعات زيستي از بانكهاي اطلاعاتي است . با توجه به اينکه انتخاب و طراحي پرايمر مناسب براي PCR، oligo hybridization و DNA sequencing ضروري مي باشد، برنامه هاي بيوانفورماتيك گوناگوني جهت طراحي جفت پرايمر از توالي هاي ژنتيكي وجود دارد با اين وجود در زمان يك آزمايش مهم PCR معمولا استفاده از بر نامه هاي مختلف وکليه حواس و تجربيات آزمايشگاهي جهت مقايسه و انتخاب بهترين پرايمر ارزش صرف وقت را دارد.
نرم افزارهاي طراحي پرايمر :
برنامه هاي متعدد متفاوتي امروزه براي طراحي پرايمر در دسترس مي باشد . نرم افزارهاي با استفاده آزاد، در اينترنت قابل دسترسي مي باشند و تعداد زيادي از سايتهاي دانشگاههاي مختلف وجود دارد که ميتوان با وارد شدن به آنها اقدام به آناليز تواليهاي پروتئيني و اسيد نوکلوئيكي نمود. اين نرم افزارها پكيجي هستند که شامل آناليز هاي DNA و پروتئين، تعيين ساختار دوم پروتئين ها، طراحي پرايمر، مدلسازي مولكولي، طراحي استراتژي هاي کلونينگ، ترسيم پلاسميد و آناليز آنزيمهاي محدود کننده مي باشد.
راهنماي طراحي و استفاده از پرايمر :
DNA الگووپرايمرها بايد با جزئيات بيشتري مورد نظر قرار بگيرند. کارآمدي وحساسيت PCR بطور قابل ملاحظه اي به کارآيي پرايمر ها وابسته است. توانايي استفاده از يك اليگونوکلئوتيد بعنوان پرايمر به چندين عامل بستگي دارد که عبارتند از: 1) حرکت شناسي اتصال و جداشدن primer-template در درجه حرارت annealing و extension، 2) اتصال ناجور از نظر پايداري و مكان اتصال نوکلئوتيدها، 3) ميزان کارآيي پليمراز در تشخيص و تصحيح اتصالات ناجور در دو رشته DNA. شايد مهمترين پارامتر موفقيتPCR طراحي پرايمر باشد. در شرايط مطلوب، طراحي ضعيف پرايمر ميتواند منجر به عدم کارکرد PCR شود. توالي پرايمر چند چيز از جمله طول محصول، melting temperature و محصول نهايي را تعيين ميكند. طراحي بد پرايمر مي تواند منجر به توليدکم و يا عدم توليد محصول مطلوب، توليد محصولات غير اختصاصي و يا تشكيل primer-dimer شود که با توليد محصول اصلي رقابت کرده و توليد آنرا سرکوب مي نمايد. توالي پرايمرهاي استفاده شده مي تواند تاثير بسزايي درحساسيت و اختصاصي عمل آردن واکنش داشته باشد. در زمان انتخاب پرايمرها بايد رهنمونهاي زير مد نظر قرار گيرد:
طول پرايمر:
از آنجايي که اختصاصي عمل کردن و، دما و زمان annealing هر دو تا حدي وابسته به طول پرايمر است، اين فاکتور براي PCR موفق نقطه بحراني محسوب ميشود. جهت مطالعات معمول پرايمرهاي داراي طول 30- 18 نوکلئوتيد مناسبترين هستند. پرايمر بايد داراي حداقل ١٨ نوکلئوتيد جهت جلوگيري از مشكلات زمان هيبريد شدن باشد. همچنين بايد از تواليهاي بلند نوکلئوتيد بويژه C یا G به تعداد چهار عدد يا بيشتر خودداري نمود.
نقطه ذوب (Tm):
بهترين بازه دماي ذوبOC 58-52 مي باشد که عموما براي بدست آوردن بهترين محصول دماي پايين تر از اين محدوده دمايي مناسب نمي باشد. در عين حال بايد از طراحي پرايمرهايي با دماي ذوب بالاتر از 65OC نيز بخاطر پتانسيل secondary annealing اجتناب شود. به همين علت در پروسه تعيين سكانس نوکلئوتيدها در واکنش sequencing، دماي annealing و extension، 60°C پيشنهاد ميشود. محاسبه حدود تقريبي کاربردي دماي واسرشتي از فرمول Wallace، Tm = 2(A+T) + 4(G+C) (عموما براي 30-18 نوآلئوتيد قابل استفاده مي باشد) محاسبه مي شود. که با استفاده از دماهاي حول وحوش دماي محاسبه شده، دماي مناسب تخمين زده ميشود.
تعداد نوآلئوتيدهاي G ، C(موثر بر Ta و Tm):
پرايمرها بايد داراي محتواي GC بين 60-45 درصد باشند. براي پرايمرهايي با محتواي GC کمتر از ٥٠ % ضروري است داراي تعداد بازهاي بيشتر از ١٨ باشند تا دماي ذوب بالاي حداقل ممكن يعني 50°C قرار گيرد. محتواي GC، دماي ذوب و دماي هم سرشته سازي پرايمرها کاملا بهم وابسته اند.
توالي 3′-End :
بدرستي مشخص است که وضعيت انتهاي 3′ پرايمر براي کنترل اشتباه اوليه بسيارحياتي است. پرايمرها بايد در انتهاي 5′ نسبت به انتهاي 3′ خود چسبنده تر باشند. يك انتهاي چسبنده 3′ با تعداد بالاي GC نشان دهنده اينست که پرايمر مي تواند به DNA الگو بطور مستحكم بچسبد. اما با در نظر گرفتن اين شرط وجود Gو C در انتهاي 3′ مطلوب است. اين گيره GC از ايجاد باندهاي ثانويه قلابي جلوگيري ميكند. رهنمود عملي اينست که از ميان سه نوآلئوتيد انتهاي’3 دو نوکلئوتيد G یا C مي تواند مناسب باشد.
دايمرها و شروع اشتباه علت ايجاد نتايج گمراه کننده:
پرايمرها نبايد داراي بازهاي مكمل يكديگر باشند و همچنين نبايد ساختارهاي سنجاقي شكل ايجاد کنند. اگر اين ساختارها وجود داشته باشند يك پرايمر روي خود تاخورده و از ايجاد محصول جلوگيري ميكند . سنجاقهايي که در کمتراز 50°C شكل مي گيرند مشكل محسوب نمي شوند. ضمنا پرايمرها نبايستي شامل تواليهاي نوکلئوتيدي باشند که باعث اتصال با خود پرايمر ويا پرايمر ديگر شوند. (تشكيل پرايمردايمر).
اختصاصي بودن:
همان گونه که ذکر گرديد اختصاصي بودن واکنش تا حدي به طول پرايمر وابسته است. بديهي است که پرايمري با 24 نوکلئوتيد از پرايمري با ١۵ نوکلئوتيد اختصاصي تر عمل مي نمايد. همچنين پرايمر ها بايد طوري انتخاب شوند که در روي DNA الگو تنها يك مكان براي اتصال داشته باشند. طراحي پرايمري با تكرر زياد تواليها منجر به ايجاد اسميري از محصولات مختلف مي شود. بنابراين يك جفت پرايمر مناسب بايد تنها ايجاد يك باند نهايي نمايد.
پرايمرهاي Degenerate:
پرايمرهاي Degenerate که مبتني برتوالي اسيدهاي آمينه هستند و منطقه خاصي را مي پوشانند براي جستجوي خانوادههاي ژني و يا شناسايي ويروسهاي جديد هم خانواده و هم جنس استفاده ميشوند.
توالي پرايمر مكمل:
تواليهاي پرايمرها را بايد طوري طراحي کرد که حداکثر واجد ٣ جفت باز همولوگ در توالي خودباشند. در صورت مكمل بودن بازهاي مياني دو پرايمر با يكديگر امكان اتصال اين پرايمرها وجود دارد. و اگر اين همانندي باز ها در انتهاي 3′ باشد احتمال ايجاد پرايمر دايمر وجود دارد.
پيشنهادات ديگر:
غلظت پرايمر موجود در واکنش بايد بين 0.1 و 0.5 ميكروليتر باشد. در صورت امكان توسط جستجوي کامپيوتري بايد مشخص نمود که پرايمر و بخصوص 10-8 باز اوليه آن با انتهاي 3′ وکتور و يا DNA insert همخواني دارد. Inosine نبايد در توالي پرايمر وجود داشته باشد توصيه مي گردد در صورتي که استفاده از پرايمرهاي منتشر شده مورد نظر است، حتما قبل از طراحي و سفارش ساخت با استفاده از برنامه Blast N بانكهاي ژني را جستجو نمود تا از کيفيت پرايمر طراحي شده و عدم مشابهت آن با ژنوم ميزبان اطمينان حاصل شود، ضمن اينكه امكان وارد نمودن نوکلئوتيدهاي دژنره جهت پوشش تمام عيار DNA هدف امكان پذير مي باشد.
منابع:
-Binas M (2000). Designing PCR primers on the web. Biotechniques 29: 988-990.[Pubmed]
-Dieffenbach CW, Lowe TMJ, Dveksler GS (1995). General Concepts for PCR Primer Design. In: PCR Primer, A Laboratory Manual, Dieffenbach CW, Dveksler GS Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 133-155.
-Erlich HA, Gelfand D, Sninsky JJ (1991). Recent advances in the polymerase chain reaction. Science 252: 1643-1651. [Pubmed]
-Lowe T, Sharefkin J, Yang SQ, Dieffenbach CW (1990). A computer program for selection of oligonucleotide primers for polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 18: 1757-1761. [Pubmed]
